Прибор для исследования вирусной инфекции клеток методом динамической ГРВ: конструкция и возможности

*Богдасарова О.В., *Богдасаров О.Е., *Девятков В.В., **Цилинский Я.Я., **Суетина И.А.

* кафедра «Информационные системы и телекоммуникации» МГТУ им. Баумана; ** ГУ НИИ Вирусологии им. Д . И . Ивановского РАМН

Кирлиан-свечение живых объектов относится к числу широко изучаемых биофизических явлений. Однако вирусы как живые организмы не входили в круг объектов исследования. Имеющиеся ГРВ приборы предназначены в основном для клинических исследований не были пригодны для изучения вирусов. Перед нами стояла задача разработать прибор, позволяющий выявить наличие эффекта Кирлиан и воспроизвести его у вирусов человека и животных с помощью динамической ГРВ.

Структура системы исследования

Исследование свойств ГРВ – свечения проводится на установке, структурная схема которой приведена на рис. 1.

Описание экспериментальной установки: На проводящую металлическую пластину установлена система крепления тонкой металлической иглы, выполненная из непроводящего фторопласта. Также на проводящую пластину жестко установлена камера, с помощью которой осуществляется съемка ГРВ — свечения. Управление камерой, всеми блоками, а также формирование и обработка видеофайла ГРВ – свечения осуществляется многомодульной программой GRV – Virus, структура которой приведена на рис. 2.

Описание схемы эксперимента : На металлическую пластину под иглу устанавливается чашка Петри, в которой находятся исследуемые клетки. Программа GRV-Virus, запускает камеру, а после полусекундной задержки — блок управления длительностью искры, который осуществляет подачу высокого напряжения на иглу в течении 1 секунды. После этого камера работает еще в течение 0,5 секунды и выключается. Затем программа GRV-virus автоматически запускает модуль разбивки видео файла на составляющие кадры. Т.о. результатом съемки является avi – файл длительностью 2 сек, состоящий из 50 кадров (растровых файлов bmp), 25 из которых являются информативными, т.е. содержат изображение искры свечения. После этого запускается модуль расчета значения характеристических признаков.

Рис. 1. Структурная схема системы исследования вирусных инфекций методом ГРВ

Рис. 2. Основные модули программы GRV – Virus.

Выделение характеристических признаков

При анализе ГРВ – изображений в качестве характеристических признаков используются следующие характеристические признаки:

• абсолютные характеристики: площадь пятна изображения (в пикселях); усредненное значение яркости пятна; усредненные значения каждой из цветовых составляющих пикселя пятна изображения.
• интегральные характеристики: спектральное распределение яркости.

Выделение пятна изображения происходит по следующему алгоритму. Для выделения пятна задаются двумя пороговыми значениями – порогом яркости (при превышении этого значения точка считается частью пятна изображения) и порогом расстояния, который необходим для неполучения ложных результатов.

При обработке изображения рассчитывают яркость каждой точки и сравнивают ее с пороговой. Если яркость больше порога, то точка добавляется к расчету. По окончании обработки по пороговой яркости формируется пятно изображения, в котором кадры наложены друг на друга.

Кадры накладываются друг на друга, по следующему правилу: при совпадении координат (одна и та же точка разных кадров) «правильной» считается точка с большей яркостью.

При использовании такого правила возможно возникновение следующей ситуации, проиллюстрированной на рис. 3.

Рис. 3. Получение ложного результата при движении искры во время эксперимента.

Во время эксперимента искра может быть нестабильной. Воздействие этих факторов приводит к движению искры относительно иглы во время съемки, что в свою очередь сказывается на точности полученных результатов.

Во избежание подобной ситуации и введено пороговое значение расстояния. В этом случае первые n кадров съемки считаются «эталонными». Как только в обработку попадает кадр n+1 для всех точек яркость, которых оказалась больше пороговой рассчитывается расстояние до соответствующих точек «эталонных» кадров. Если это расстояние превышает пороговое, т такая точка в обработке не участвует (см. рис. 4). Практика показала, что использование порогового значения расстояния позволило в несколько раз повысить сходимость полученных результатов.

Рис. 4. Иллюстрация порогового расстояния.

При анализе bmp файлов используется аддитивная цветовая модель RGB пикселей изображения. Для каждой точки выделяется значение красной (R), зеленой (G) и синей (B) составляющей цвета. При 8 битной глубине цвета для стандартных bmp файлов получаем, что значения цветовых характеристик лежат в диапазоне от 0 (для фоновых точек) до 255 (для наиболее ярких точек пятна свечения).

Расчет числовых значений характеристических признаков происходит по следующим формулам:

где R, G, B – средние значения красной, зеленой и синей составляющих соответственно; R i , G i , B i – значения красной, зеленой и синей составляющих для каждой точки пятна свечения соответственно; BR, BR i – среднее и i – ое значение яркости рассчитанное по формуле:

BR = 0,3•R + 0.59•G + 0.11•B

Весовые коэффициенты цветов определяются исходя из субъективного восприятия их человеком. Кроме этого для яркости строится спектральное распределение, пример которого приведен на рис. 5.

Результаты исследования. Результаты динамического ГРВ изучения вирусов характеризуются не только новизной, но и относятся к разряду фундаментальных. Установлено Кирлиан – свечение как у первичных, так и у перевиваемых культур клеток человека и животных. Выявлено различие между ГРВ – граммами контрольных и зараженных клеток. ГРВ – граммы контрольных культур и клеток, зараженных вирусами различных групп отличались по площади свечения, спектральному распределению яркости, а также усредненных значений красной, зеленой и синей составляющих видимого спектра излучения. Подобные различия были установлены у 4 вирусов, использующих различный генетический материал (РНК и ДНК), далеко отстоящих друг от друга в систематике (род, семейство) и имеющих разную стратегию генома.

Также предложенный метод позволяет проследить развитие вирусной инфекции в зараженных клетках. На рис. 6а и 6б представлены диаграммы площади ГРВ — свечений вирусов везикулярного стоматита (ВВС), осповакцины (ВоВ) и контрольных клеток через 2 и 5 часов после заражения соответственно .

Перспективы исследования.

В дальнейших исследованиях предполагается накопление статистического материала по значению характеристических признаков для различных вирусов, использование методов распознавания образов для определения неизвестных вирусов на основе накопленных статистических данных, например метод ближайших соседей, нечеткие и pi исчисления. Также планируется повысить точность исследуемого метода за счет стабильного поддержания высокого напряжения, генерируемого соответствующим блоком.

Литература:

1. Поляков А.Ю., Брусенцев В.А. Методы и алгоритмы компьютерной графики в примерах на Visual C ++, 2-е изд., перераб. и доп. – СПб.:БХВ-Перербург, 2003 – 560 с.