Результаты изучения вирусной инфекции эукариотических клеток, культивируемых ин витро, динамическим ГРВ методом

*Цилинский Я.Я., *Суетина И.А., **Богдасарова О.В., **Богдасаров О.Е., **Девятков В.В.

*- лаборатория популяционной генетики ГУ НИИ вирусологии им. И.В. Ивановского РАМН, Москва.

** — Кафедра «Информационные системы и телекоммуникации» МГТУ им.Н.Э.Баумана, Москва.

Об исследованиях вирусов, проведенных нами методом ГРВ, сообщалось ранее (1, 2). Задачей настоящей работы было получение ГРВ-грамм культур клеток, инфицированных различными вирусами, и их анализ с целью дифференцировки Кирлиан свечения зараженных и контрольных культур, получения данных об изменении характера свечения по мере развития инфекции, а также для выявления различий в свечении между различными вирусами.

Материал и методы

В работе были использованы РНК-содержащие вирусы: вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), вирус везикулярного стоматита (ВВС), поливирус I , ECHO II , и ДНК-содержащий вирус – осповакцины (ВОВ). В соответствии с восприимчивостью клеток к вирусной инфекции опыты с вирусами ВЭЛ, ВВС и ВОВ проводились на 2х культурах – перевиваемых фибробластах человека (ПФЧ), и первичных культурах куриных фибробластов (КФ). В опытах с вирусами полио I , и ECHO II – использовались только ПФЧ. Вирус ВЭЛ очищали и концентрировали дифференциальным центрифугированием с использованием в качестве одного из этапов очистку в градиенте плотности сахарозы 20-60%. Вирус суспензировали в трис-буффере. Инфекционный титр был около 11 ТЦД 50/мл.

Для ГРВ исследования использовали 24 – 48 часовые культуры ПФЧ и КФ, выращенные в чашках Петри диаметром 38 мм в термостате СО2. Из чашек удаляли ростовую среду, вносили вирус и через час добавляли поддерживающую среду по 1 мл на чашку. Культуры помещали в термостат СО2 при 37? С. Заражающие дозы в зависимости от задачи опыта колебались от 10? ТЦД50 и выше на чашку, а время инкубации от внесения вируса до момента исследования – от 2 до 24 часов.. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла с двойным набором аминокислот (для ПФЧ) или минимальную среду Игла (КФ). Среды содержали 1% эмбриональной сыворотки коровы или сыворотки новорожденных телят и антибиотики.

Получение и изучение эффекта Кирлиан при вирусной инфекции проводилось на предложенном нами аппарате для динамической ГРВ по специальной программе (3).

Результаты и обсуждение.

Эффект Кирлиан относится к общебиологическим явлениям. В нашей работе получены доказательства возникновения Кирлиан свечения как у перевиваемых (ПФЧ), так и у первичных (КФ) клеточных культур человека и животных. Первичные культуры (КФ) быстро гибнут, а перевиваемые (ПФЧ) обладают потенциальным бессмертием и могут продолжаться в неограниченном числе поколений. При этом клетки сохраняют способность к Кирлиан свечению (рис.1).

В свечении зараженных и контрольных культур выявлялись различия. Как следует из рис.4, эти различия при инфекции ВВС и ВОВ проявлялись при сравнении площади свечения. На рис.3 показаны различия в средней зеленой составляющей видимого спектра излучения. Дифференцирующими признаками служили также красные и синие составляющие видимого спектра излучения и его яркость. В целом специфическое Кирлиан свечение было выявлено в опытах с 5 вирусами на 2-х культурах ( табл.1).

Для определения, связано ли свечение с вирусной инфекцией или с наличием зрелого вируса в клеточных культурах, было проведено изучение наличия эффекта Кирлиан у концентрированного и очищенного вируса ВЭЛ. ГРВ-граммы суспензий вирионов ВЭЛ, полученные из концентрированного вируса, а также из вируса, инактивированного формалином, и не отличались от ГРВ-свечения контрольного раствора трис-буфера (рис.2). Это позволяет говорить, что свечение зараженных культур связано не с накоплением зрелого вируса (вирионов), а с макромолекулярными процессами синтеза вирусных компонентов в процессе его репродукции.

Из рис.3,4 также следует, что в процессе размножения вирусов в инфицированных культурах клеток выявляются изменения в ГРВ-свечении: по его площади и усредненному значению зеленой составляющей видимого спектра излучения. Кроме того наблюдались различия в спектральном распределении яркости и усредненном значении красной и синей составляющей. ГРВ-граммы инфицированных клеток через 2 часа после внесения вируса отличались от ГРВ-грамм этих же клеток, полученных в дальнейшем через различные интервалы времени.

Важно отметить, что ГРВ-граммы инфицированных клеток у всех 5 изученных вирусов (табл.1) не только четко отличались от контрольных, но и различались между собой. Эта специфика была выявлена у вирусов, использующих различный генетический материал (РНК и ДНК), далеко отстоящих друг от друга в систематике (род, семейство) и имеющих в силу этого характерную только для них стратегию генома.

Заключение.

Полученные данные показывают, что при вирусной инфекции клеток возникает специфическое Кирлиан свечение, отличное от свечения незараженных культур. Это свечение изменяется во времени по ходу инфекционного процесса и зависит от вируса (является характерным для каждого вируса).

Таблица 1. Кирлиан свечение клеточных культур при вирусной инфекции

Литература:

1. Цилинский Я.Я., Суетина И.А., Богдасарова О.В., Богдасаров О.Е., Девятков В.В., Эффект-Кирлиан в культурах клеток, инфицированных вирусами, Тезисы IX Межд. Науч. Конгр. по ГРВ биоэлектрографии «Наука. Информация. Сознание», СПб, 2005,с.202
2. Клименко С.М., Цилинский Я.Я., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Суетина И.А., Богдасарова О.В., Богдасаров О.Е., Девятников В.В., Возможность индикации вирусных патогенов при помощи атомной силовой микроскопии и газоразрядной визуализации (эффект Кирлиан), Тезисы II Межд. Конфер. «Молекулярная медицина и биобезопасность», М., 2005,с.157-158.
3. Богдасарова О.В., Богдасаров О.Е., Девятков В.В., Цилинский Я.Я., Суетина И.А., Прибор для ииследования вирусной инфекции культур клеток методом динамической ГРВ: Конструкция и возможности, Тезисы Х Межд.Науч. Конгр. По ГРВ биоэлектрографии «Наука. Информация. Сознание», СПб, 2006